Mikrobiologische Überwachung der Wasserqualität mittels Schnellanreicherungsverfahren und DNA-Mikroarray (PATHOGENSCAN)< zurück

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Gewässerüberwachung und Qualitätskontrolle sind von entscheidender Bedeutung für die Sicherheit der öffentlichen Gesundheit und bei der Bewertung und Weiterentwicklung z.B. in der Abwasser- und Rohwasserbehandlung. Herkömmliche Kultivierungsverfahren zur Detektion und Quantifizierung von pathogenen Organismen sind zeitintensiv und einige Viren sind nur schlecht oder gar nicht kultivierbar.

Daher wird in diesem Forschungsvorhaben eine Kombination von PCR-Verfahren und DNA-Mikroarray entwickelt, mit dessen Hilfe wasserrelevante Krankheitserreger detektiert werden sollen. Auf dem DNA-Mikroarray sind spezifische Sonden für die verschiedenen Mikroorganismen immobilisiert. Die Quantifizierung der Hybridisierungsreaktion auf dem Chip erfolgt über die Entstehung eines Chemilumineszenzsignals. Das Auslesen des Signals geschieht durch die im Durchfluss betriebene Mikroarray-Plattform MCR3.

Je nach Art der Wasserprobe sind verschiedene Schnellanreicherungsmethoden notwendig, die mit der Mikroarray-basierten Plattform kombiniert werden können. Für die schnelle Identifizierung und Quantifizierung müssen zunächst effiziente Anreicherungsmethoden entwickelt werden, die für unterschiedliche Wassermatrices optimiert sind. Zur Anwendung kommen die Glaswolle- und Crossflow-Filtration, Kationen-beschichtete Filter sowie die monolithische Affinitätschromatographie.

Bei der Isolierung der Nukleinsäuren der Organismen werden verschiedene Extraktionsmethoden für RNA und DNA in Bezug auf die Extraktionseffizienz und die Entfernung von Inhibitoren verglichen. Für RNA-haltige Organismen ist ein zusätzlicher cDNA Synthese-Schritt notwendig. Die PCR-Reaktion wird dahingehend weiterentwickelt, dass sie eine lebend-tot-Unterscheidung ermöglicht.

Um das online-Quantifizierungssystem validieren zu können, muss zunächst eine Referenzanalytik für die Detektion der Mikroorganismen verfügbar sein. Dazu werden qPCR-assays zur Quantifizierung der pathogenen Organismen entwickelt. Neben der molekularbiologischen Referenzanalytik werden für ausgewählte Organismen standardisierte Kulturverfahren durchgeführt und mit der qPCR Analytik verglichen.

Ziel der deutsch-israelischen Kooperation in diesem Vorhaben ist die Entwicklung eines schnellen Nachweissystems für die Detektion von pathogenen Viren, Bakterien und Parasiten, sowie Indikatororganismen (Norovirus, Adenovirus, Rotavirus, Bakteriophagen MS2 und PhiX174, E. coli, E. faecalis, L. pneumophila, P. aeruginosa, Cryptosporidium und Giardia) für reale Wasserproben (z.B. Oberflächenwasser, Rohwasser, Trinkwasser, Badewasser).

AnsprechpartnerIn

M.Sc. Biol. Johannes Otto

Tel.: +49(0)721/9678-136
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Förderung

BMBF - Bundesministerium für Bildung und Forschung

Projektdauer

2010 - 2013